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鎳-瓊脂糖凝膠6FF（Ni-NTA Resin）

Ni-NTA瓊脂糖凝膠6FF是用于純化6×His標(biāo)簽重組蛋白的一種純化介質(zhì)，它是由6%交聯(lián)的Sepharose耦連了一種四齒螯合劑NTA而得. 它可用于在非變性或變性條件下純化任何表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的6×His標(biāo)簽重組蛋白。NTA，含有四個(gè)螯合區(qū)，較一般的三齒螯合劑能更好的結(jié)合Ni2+。6×His可與Ni2+螯合，從而使His標(biāo)簽蛋白結(jié)合在Ni-NTA純化介質(zhì)上，未結(jié)合的蛋白被洗滌下去，結(jié)合在介質(zhì)上的蛋白經(jīng)過(guò)一定濃度的咪唑或低pH緩沖液的溫和洗脫下來(lái)，從而得到高純度的目的蛋白。該純化介質(zhì)與His標(biāo)簽蛋白具有*的親和力，可達(dá)5-20 mg/ml?？稍诜亲冃院妥冃詶l件下純化任何表達(dá)系統(tǒng)所得的His標(biāo)簽蛋白。純化程序簡(jiǎn)單，所得的蛋白純度可高達(dá)95％。Ni-NTA可再生4-6次，重復(fù)使用。本產(chǎn)品懸浮液為20％乙醇，已螯合Ni2+。

操作方法：

A. 非變性條件下抽提His標(biāo)簽蛋白

1) 準(zhǔn)備細(xì)胞，接種，誘導(dǎo)表達(dá)。收集細(xì)胞，置于-70°C或立即進(jìn)行步驟2操作。

2) 加入1/20細(xì)胞生長(zhǎng)體積的NTA-0 Buffer和PMSF。PMSF使用的工作濃度為1 mM現(xiàn)用現(xiàn)加。

3) 將細(xì)胞懸浮起來(lái)，加入溶菌酶，混勻，冰上放置30分鐘，超聲或勻漿破碎細(xì)胞。該步驟冰上操作。

4) 加入10% Triton X-100, 使終濃度為0.05%，充分混勻，冰上放置15分鐘。

5) 12000 rpm/min(20,000×g以上)，4°C離心15分鐘以上。取上清，置于冰上備用或-20°C保存。

6) 將NTA樹(shù)脂裝入合適的層析柱，層析用10倍NTA體積的NTA-0 Buffer洗。

7) 將樣品加NTA層析柱中，流速在15 ml/h左右，收集穿透部分，用SDS/PAGE分析蛋白的結(jié)合情況。

8) 層析用5倍NTA體積的NTA-0 Buffer洗，流速控制在30 ml/h左右。

9) 分別用5倍NTA體積的NTA-20、NTA-40、NTA-60、NTA-80、NTA-100、NTA-200、NTA-1000 Buffer洗脫，流速控制在15 ml/h左右，收集洗脫液，每管收集一個(gè)NTA體積。

10) 確定目標(biāo)蛋白質(zhì)在洗脫液中的分布情況。為有效的方式是SDS-PAGE分析。也可以用Bradford 蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒，快速確定蛋白質(zhì)的含量，然后用SDS/PAGE分析蛋白質(zhì)的分布。

11)純化的目標(biāo)蛋白質(zhì)的保存條件需要根據(jù)蛋白質(zhì)的性質(zhì)和用途確定。 NTA-0 、20、40、60、80、100、200、1000Buffer分別為濃度20 mM Tris-HCl pH7.9, 0.5 M NaCl, 10% Glycerol，添加0、20、40、60、80、100、200、1000 mM Imidazole。

B.變性條件下從包涵體中純化His標(biāo)簽蛋白

1) 準(zhǔn)備細(xì)胞，接種，誘導(dǎo)表達(dá)。收集細(xì)胞，置于-70°C或立即進(jìn)行步驟2操作。

2) 加入1/20細(xì)胞生長(zhǎng)體積的GuNTA-0 Buffer和PMSF。PMSF使用的工作濃度為1 mM現(xiàn)用現(xiàn)加。

3) 將細(xì)胞懸浮起來(lái)，冰上超聲破碎細(xì)胞，降低粘稠度。

4) 室溫放置30分鐘，間或混勻或用磁力攪拌。

5) 12000轉(zhuǎn)/分（20,000×g以上），4°C離心15分鐘以上。取上清，置于冰上備用或-20°C保存。

6) 將NTA樹(shù)脂裝入合適的層析柱，層析用10倍NTA體積的GuNTA-0 Buffer洗。

7) 將樣品加到NTA層析柱中，流速控制在15 ml/h左右，收集穿透部分，用于SDS/PAGE分析蛋白質(zhì)的結(jié)合情況。

8) 層析用5倍NTA體積的GuNTA-0 Buffer洗，流速控制在30 ml/h左右。

9) 分別用5倍NTA體積GuNTA-20、GuNTA-40，GuNTA-60、GuNTA-100、GuNTA-500洗脫，流速在15 ml/ h左右，收集洗脫液，每管收集一個(gè)NTA體積。

10) 確定目標(biāo)蛋白質(zhì)在洗脫液中的分布情況。為有效的方式是SDS/PAGE分析。也可以用Bradford 蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒，快速確定蛋白質(zhì)的含量，然后用SDS/PAGE分析蛋白質(zhì)的分布。

11) 目標(biāo)蛋白質(zhì)需要進(jìn)一步純化需要根據(jù)蛋白質(zhì)的用途確定。

12) 純化的目標(biāo)蛋白質(zhì)需要復(fù)性，復(fù)性常用的手段可以參考有關(guān)手冊(cè)確定的原則。

GuNTA-0 、20、40、60、100、500Buffer分別為濃度20 mM Tris-HCl pH7.9, 0.5 M NaCl, 10% Glycerol,6 M Guanidium HCl添加0、20、40、60、100、500 mM Imidazole。

C. NTA樹(shù)脂的再生

NTA樹(shù)脂在使用若干次數(shù)（3-5次）后，結(jié)合效率有所下降，可以用以下方法再生，提高樹(shù)脂的使用壽命和蛋白質(zhì)的結(jié)合效率。

NTA樹(shù)脂再生前需要從層析柱下端流干所有溶液，估計(jì)出NTA的樹(shù)脂體積，按下列次序?qū)⒃偕噭┘拥綄游鲋?，在等上一步再生溶液流干后，再加下一步再生溶解?/p>

用戶(hù)需要自行準(zhǔn)備25%、50%、75%、100%（v/v）乙醇和去離子水。 從層析柱下端流干所有溶液，用2倍NTA樹(shù)脂體積的Stripping Solution I、2倍體積的去離子水、3倍體積的Stripping Solution II、1倍體積的25%乙醇、1倍體積的50%乙醇、1倍體積的75%乙醇、5倍體積的100%乙醇、1倍體積的75%乙醇、1倍體積的50%乙醇、1倍體積的25%乙醇、1倍體積的去離子水、5倍體積的Stripping Solution III、3倍體積的去離子水分別洗一遍。

如果立即使用，用5倍體積的Ni Charging Solution洗，再用10倍體積的平衡溶液（NTA-0Buffer或GuNTA-0 Buffer）洗；如果想長(zhǎng)期儲(chǔ)存，加入1倍體積的20%乙醇，4°C保存，使用前用5倍體積的Ni Charging Solution洗，再用10倍體積的平衡溶液（NTA-0Buffer或GuNTA-0 Buffer）洗

再生溶液配方：Stripping Solution I:  6M GuHCl, 0.2M acetic acid。Stripping Solution II: 2% SDS。        Stripping Solution III: 100 mM EDTA, pH 8.0。Ni Charging Solution: 100 mM NiSO4

鎳-瓊脂糖凝膠6FF（Ni-NTA Resin）